Anton Paar od wielu lat aktywnie działa w dziedzinie mikromechanicznych badań materiałów biologicznych i biomateriałów. Po zdobyciu dużego doświadczenia w testach materiałów biologicznych suchych twardych jak zębiny lub kości w warunkach zarówno suchych jak i płynnych, następnym krokiem były badania w dziedzinie tkanek miękkich. Rosnące potrzeby przeprowadzania testów związanych z biologią oraz środowiskiem medycznym do charakteryzacji miękkich materiałów biologicznych i biokompatybilnych zapoczątkowały rozwój techniki służącej takim testom.

Charakterystyka próbek których sztywność jest bardzo niska (moduł sprężystości ~ 10 MPa i mniej) wymagała nowego urządzenia do nanotwardości. Nowy tester BHT (Biotwardościomierz) spełnia wymagania takie jak:

  • Niski zakres obciążania,
  • Duży zasięg przemieszczenia pionowego,
  • Zdolność do pomiaru próbek w cieczach,
  • Zautomatyzowana procedura badania dla próbek o nieregularnym kształcie.

Ponadto, nowe urządzenie oferuje możliwość wizualizacji, dobrą stabilność termiczną, wystarczającą dokładność do przeprowadzania testów oraz możliwość opcjonalnego podgrzewania w celu odtworzenia środowiska biologicznego.

rtemagicc_bht_ttx_and_controllers-617

Bioindenter

Nowe urządzenie jakim jest bioindenter został opracowany we współpracy ze specjalistami z biologii  Laboratorium CSEM (Szwajcaria). Ta współpraca doprowadziła do adaptacji i weryfikacji protokołów nanotwardości dla próbek biologicznych. Bioindenter może stosować obciążenia od ~ 0,01 mN do 20 mN o całkowitym przesuwie wgłębnika większym niż 100 mm. Urządzenie jest oparta na Ultra Nanotwardościomierzu (UNHT). Specjalne wgłębniki zostały opracowane w celu umożliwienia pomiarów próbek zanurzonych w cieczach i zmniejszenia efektów kapilarnych.

rtemagicc_indenteur_bille_01

Wgłębnik stosowany przy bioindentacji.

Wgłębniki są dostępne w różnych geometriach. Najczęściej stosowane jest geometria kulista i wgłębniki płaskie (flat punch). W celu ułatwienia testowania próbek biologicznych, bioindenter zawiera specjalnie zaprojektowany uchwyt na szalki Petriego umożliwiający łatwe przenoszenie próbek. Opcjonalne grzanie jest dostępne dla tego uchwytu w celu kontrolowania próbek w temperaturze 50 °C. Zmotoryzowane stoliki XY z dokładnością repozycjonowania 1 mm zapewniają precyzyjne pozycjonowanie boczne; stolik w osi Z z napędem umożliwia automatyczne podejście wgłębnika, dzięki czemu pomiar wykonywany jest w pełni automatycznie. Mikroskop umożliwia obrazowanie z góry próbki, dodatkowo mikroskopu może być zamontowany pod próbką, aby umożliwić obserwację in situ w czasie eksperymentu.

Technika bioindentacji

Protokół pomiarowy próbek biologicznych uwzględnia nieregularności powierzchni próbki przez wprowadzenie procedury automatycznego wykrywania powierzchni w matrycy pomiarowej. Wykrywanie powierzchni przez oprogramowanie Indentation wykorzystuje zmianę sztywności, aby uniknąć fałszywego wykrywania kontaktu wyniku działania sił zewnętrznych (kapilarnych, etc.). Zastosowanie wgłębników sferycznych ułatwia wykrywanie kontaktów na próbkach bardzo miękkich (hydrożele, chrząstki, etc.).

Bioindentację można stosować w testach chrząstek, ścięgien, rogówki, przy regeneracji tkanek, roślinach, hydrożelach, elastomerach (Ebenstein i Pruitt, 2006; Oyen, 2010). Oprócz modułu sprężystości, można również ocenić właściwości pełzania i poroelastyczne tych materiałów (Hu et al, 2010;. Kaufman et al, 2008;.. Menčík et al, 2009).

Aplikacje Biotwardościomierza

Aplikacje Bioindentera są bardzo szerokie. Wiele tkanek ludzkich poddawanych jest obciążeniom mechanicznym i ich charakterystyka mechaniczna może dostarczyć cennych informacji odnosnie choroby, leczenia, a także rozwoju sztucznych zamienników (np. implantów). Bioindentacja może być stosowana do diagnostyki choroby (funkcje wątroby, tętnice) i podstawowych badań naukowych dotyczących leczenia tych chorób (Hu et al, 2012,.. Levental et al, 2010; Oyen, 2010). Technika ta znajduje również swoje zastosowanie w rozwijającej się dziedzinie badań biomimetycznych gdzie struktura i właściwości mechaniczne tkanek muszą być dokładnie charakteryzowane. Właściwości mechaniczne uzyskane w ten sposób są ściśle związane z lokalną strukturą materiału dzięki czemu uzyskujemy ważne informacje o biomechanicznej odpowiedzi tkanki.

Fundamentalną zaletą biotwardościomierza jest jego zdolność do badania właściwości tkanek biologicznych w skali tkanek w celu zrozumienia ich mechanicznego zachowania. Często należy to zrobić, aby znaleźć potencjalne materiały zastępcze, których właściwości i zachowanie muszą ściśle odpowiadać zastąpionym tkankom. Bioindenter jest unikalnym narzędziem do testowania zarówno tkanek jak i ich potencjalnych materiałów zastępczych.

Chrząstki

Zapalenie kości i stawów jest jedną z najczęstszych chorób stawów, które dotykają około pięćdziesiąt procent populacji świata. Mimo pewnych postępów dokonanych w leczeniu tej choroby, różne mechanizmy inicjacji choroby, efekty zabiegów medycznych nie są w pełni poznane. Wiele laboratoriów jest więc zainteresowanych prowadzeniem badań, które opierają się na charakterystyce właściwości mechanicznych chrząstki w różnych stadiach choroby wraz ze zrozumieniem wpływu różnych zabiegów. Eksperymenty wykonywane są niemal wyłącznie na małych zwierzętach laboratoryjnych, tj szczurach lub myszach przynoszących bardzo małe próbki o małych obszarach badawczych. Zastosowanie Bioindentera w tym badaniu oferuje odpowiednie obciążenia i zakres głębokości wraz z wysoką rozdzielczością boczną dla testów na małych próbkach chrząstek. Wyniki testów nanotwardości zostają wykorzystane w celu rozwoju i oceny leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów i badania różnych efektów w rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Jednym z tematów badawczych jest także mapowanie właściwości mechanicznych chrząstki w odniesieniu do poziomu obciążenia, przyłożonego w danej strefie. Szczegółowe badania przeprowadzono na kości udowej szczura w celu określenia właściwości trzech stref na kości udowej: strefa przednia (1), strefa tylna (3) i górna (3). Przednia i tylna strefa(1 i 3) są lekko obciążane podczas gdy górna strefa (3) jest mocno dociążana w ciągu życia szczura. Wyniki pomiarów Bioindenterem z kulistym wgłębnikiem i kością udową całkowicie zanurzoną w cieczy, wykazały, że przy dużych obciążeniach strefa 2 ma znacznie większy moduł elastyczności oraz mniejszą kruchość niż przednia i tylna strefa (1 i 3). Jest to ważne odkrycie, ponieważ wskazuje na silną niejednorodność chrząstki i zależność jej właściwości na obciążenia mechaniczne w cyklu życia. Wszystkie wgniecenia zostały wykonane przy maksymalnej głębokości 15 mm (początek okresu wstrzymania). Różne sztywność i zdolność do przepływu płynu (pełzanie) znalazło odzwierciedlenie w różnych maksymalnych siłach potrzebnych do osiągnięcia wymaganej głębokości 15 mm.

1 1a

Regeneracji tkanek

Bioindentery mogą być również stosowane do badania stopnia regeneracji po uszkodzeniu w chrząstce. Badania przeprowadzono na podstawie regeneracji chrząstki po uszkodzeniu kości udowej kozy. Zwierzę uśmiercono po trzech miesiącach od przeszczepu i oba zdrowe i regenerujące obszary chrząstki zostały sprawdzone. Pomiary wykazały, że zdrowe i regenerujące chrząstki wykazywał duże różnice zarówno w module sprężystości jak i pełzaniu. W tym przypadku badany obszar był dosyć duży (~ kilku setek mikrometrów), tak że często obecne lokalne różnice sztywności w zdrowej i zregenerowanej chrząstce uśredniono. Pomiary wykazały, że chrząstka regenerująca miała znacznie większe pełzanie i ponad dziesięciokrotnie niższy moduł sprężystości niż zdrowa chrząstka. Oczywiście, regeneracja chrząstki jest w bardzo wczesnym stadium nawet po trzech miesiącach.

2 2a

Rogówka

Rogówka, część rogówkowo twardówkowa i twardówka oka reprezentują regiony, które odgrywają ważną rolę w jakości widzenia przez człowieka. Niektóre choroby rogówki lub urazy mogą prowadzić do częściowej lub całkowitej utraty wzroku lub przewlekłego bólu powierzchni oka. Leczenie takich zdarzeń może polegać na wzroście komórek macierzystych. Przeżywalność i własne odnowienie komórek macierzystych silnie zależy od biomechanicznych właściwości środowiska, czyli rogówki, twardówki i obszaru między nimi. Dlatego wystepuje duże zainteresowanie w celu zbadania modułu sprężystości i przepuszczalności części wspólnej w celu oceny właściwości biomechanicznych tej unikalnej struktury na powierzchni oka. Niektóre z metod jak UVA, mogą mieć również wpływać na sztywność i przepuszczalność rogówki. Pomiar tych zmian jest ważnym czynnikiem dla oznaczenia efektywności sposobu leczenia. W badaniach wykorzystano Bioindenter wykonano pomiary w obrębie trzech obszarów oka, w celu uzyskania modułu sprężystości oraz porównania właściwości pełzania (zdolność przepływu cieczy pod wpływem obciążeń mechanicznych) w tych obszarach.

3 3a

Hydrożele

Hydrożele są materiałami bardzo miękkimi odpowiednimi dla inżynierii tkankowej, które są stosowane w różnych dziedzinach badań biologicznych i klinicznych, np. osteoporoza lub kontrola krwotoku. Wiele hydrożeli jest uważanych za potencjalnych kandydatów jako podłoże dla wzrostu tkanek miękkich w organizmie człowieka. Ostatnio stwierdzono, że elastyczność materiału podłoża może mieć istotny wpływ na homeostazę tkanki, co jest ważne dla regeneracji tkanek (Discher et al, 2005,.. Moers i inni, 2013). Oznaczanie elastycznych i mechanicznych właściwości substratów biologicznych jest zatem bardzo interesujące. Moduł sprężystości i pełzanie mogą być łatwo badane z Bioindenterem gdy przyrząd jest zgodny z testami w cieczy i może działać w różnych trybach obciążania (Nohava i wsp., 2014).

4 4a

Adhezja – elastomery i żele

Metoda bioindentacji odnosi się nie tylko do pomiarów materiałów biologicznych, ale także do pomiarów różnych elastomerów, żeli i hydrożeli, które nie wymaga zanurzenia w cieczy. Takie materiały mogą wykazywać często bardzo elastyczne zachowanie (Kohn i Ebenstein, 2013). Zjawiska te mogą być badane przy użyciu Bioindentera i jego zdolności do wykrywania bardzo małej siły działającej na wgłębnika podczas podejścia i cofania wgłębnika z powierzchni materiału. Rejestrowane krzywej obciążenie-odkształcenie może być używane do obliczania siły adhezji i energii powierzchniowej. Podczas wycofywania, gdy wgłębnik jest usuwany z powierzchni oderwanie przyczepność wytwarza ujemne siły adhezyjne które mogą być mierzone.

rtemagicc_adhesion

Wnioski

Nanotwardość tkanek biologicznych (bioindentacja) jest rozwijającą się dziedziną, która wymaga nowego podejścia eksperymentalnego i analitycznego. Pomimo, że jest stosunkowo nowa metoda, to już znalazła swoje miejsce w wielu laboratoriach na całym świecie i służy zarówno do rozwój zabiegów klinicznych jak i podstawowych badań biomechanicznych. Początkowy brak wrażliwej aparatury został niedawno skierowana przez Anton Paar.

Bioindenter oferuje wyjątkowe możliwości dla charakteryzacji materiałów biologicznych, zbadania ich zachowań i reakcji na obciążenia mechaniczne. Inną wielką zaletą Bioindentera jest możliwość pomiaru właściwości zależne od czasu często związanego z przepływem płynu w tkance, co jest ważnym czynnikiem w zrozumieniu życia i zachowanie wielu tkanek miękkich.

Autor

Dr Jiri Nohava, Anton Paar TriTec SA

Bibliografia

Discher, D.E., Janmey, P., Wang, Y., 2005. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science 310, 1139–1143.

Ebenstein, D.M., Pruitt, L.A., 2006. Nanoindentation of biological materials. Nano Today 1, 26–33.

Hu, Y., You, J.-O., Auguste, D.T., Suo, Z., Vlassak, J.J., 2012. Indentation: A simple, nondestructive method for characterizing the mechanical and transport properties of pH-sensitive hydrogels. J. Mater. Res. 27, 152–160. doi:10.1557/jmr.2011.368

Hu, Y., Zhao, X., Vlassak, J.J., Suo, Z., 2010. Using indentation to characterize the poroelasticity of gels. Appl. Phys. Lett. 96, 121904. doi:10.1063/1.3370354

Kaufman, J.D., Miller, G.J., Morgan, E.F., Klapperich, C.M., 2008. Time-dependent mechanical characterization of poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels using nanoindentation and unconfined compression. J. Mater. Res. 23, 1472–1481. doi:10.1557/JMR.2008.0185

Kohn, J.C., Ebenstein, D.M., 2013. Eliminating adhesion errors in nanoindentation of compliant polymers and hydrogels. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 20, 316–326. doi:10.1016/j.jmbbm.2013.02.002

Levental, I., Levental, K.R., Klein, E.A., Assoian, R., Miller, R.T., Wells, R.G., Janmey, P.A., 2010. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys. Condens. Matter 22, 194120. doi:10.1088/0953-8984/22/19/194120

Menčík, J., 2012. Low-load Nanoindentation: Influence of Surface Forces and Adhesion. Chem. Listy 106, 481–484.

Menčík, J., He, L.H., Swain, M.V., 2009. Determination of viscoelastic–plastic material parameters of biomaterials by instrumented indentation. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 2, 318–325. doi:10.1016/j.jmbbm.2008.09.002

Moers, K., Steinberg, T., Schlunck, G., Reinhard, T., Tomakidi, P., Eberwein, P., 2013. Substrate elasticity as biomechanical modulator of tissue homeostatic parameters in corneal keratinocytes. Exp. Cell Res. 319, 1889–1901. doi:10.1016/j.yexcr.2013.05.002

Nohava, J., Swain, M., Eberwein, P., 2014. Micromechanical Properties of Polyacrylamide Hydrogels Measured by Spherical Nanoindentation. Key Eng. Mater. 606, 121–124.doi:10.4028/www.scientific.net/KEM.606.121

Oyen, M.L., 2010. Handbook of Nanoindentation: With Biological Applications, 1 edition. ed. Pan Stanford Publishing.